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PIERCE超敏型發(fā)光液使用方法簡(jiǎn)單說(shuō)說(shuō)
瀏覽次數(shù):1711發(fā)布日期:2022-06-22
  PIERCE超敏型發(fā)光液用于檢測(cè)直接或間接標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的抗體及其關(guān)聯(lián)的抗原。其原理是,蛋白質(zhì)或核酸在電泳后轉(zhuǎn)移到印跡膜上,以一抗及HRP標(biāo)記的二抗結(jié)合膜上的目的蛋白,或以HRP標(biāo)記的探針直接或間接結(jié)合膜上的核酸。洗膜后用本產(chǎn)品配制的ECL工作液,室溫孵育膜數(shù)分鐘,將印跡膜用保鮮膜包被粘貼固定于X光片曝光暗盒。然后轉(zhuǎn)入暗室將X光膠片壓在膜上曝光數(shù)秒到數(shù)小時(shí),顯影定影后蛋白質(zhì)或核酸條帶可清晰顯示在X光膠片上。
 
  采用*的發(fā)光底物系統(tǒng),降低曝光背景的同時(shí)引入新型的氧化劑,大大提高試劑盒的穩(wěn)定性,使其在室溫能穩(wěn)定放置一年。除用于X光片,還可直接使用熒光CCD掃描,主要用于WB檢測(cè)以及化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)系統(tǒng)。
 
  PIERCE超敏型發(fā)光液使用方法:
 
  1.常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、HRP標(biāo)記抗體或核酸探針?lè)跤?、洗膜。注意用HRP標(biāo)記lgG或用一抗-鏈親和素-HRP夾法。核酸雜交膜用HRP標(biāo)記探針雜交,洗膜。
 
  2.洗滌膜上的HRP標(biāo)記二抗時(shí),配制新鮮發(fā)光工作液:分別取等體積的溶液A和B混合,放置使之升到室溫否則會(huì)減弱熒光強(qiáng)度。建議立即使用工作液,室溫放置數(shù)小時(shí)后仍可使用但靈敏度略有降低。
 
  3.用鑷子取出膜,搭在濾紙上瀝干洗液但勿使膜*干燥。將膜*浸入并與發(fā)光工作液(0.125ml發(fā)光工作液/cm2膜)充分接觸。室溫孵育1分鐘,準(zhǔn)備立即壓片曝光。孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)不會(huì)增加靈敏度,有時(shí)還會(huì)導(dǎo)致曝光條帶異常。發(fā)光過(guò)程的本質(zhì)是酶促反應(yīng),使用過(guò)少的發(fā)光工作液不利于反應(yīng)進(jìn)行,也會(huì)導(dǎo)致膜上條帶曝光不均,明顯降低靈敏度。為達(dá)節(jié)約目的可將膜剪小但勿降低發(fā)光液用量。
 
  4.用鑷子夾起膜,搭在濾紙上瀝干發(fā)光工作液。但勿洗去發(fā)光液。
 
  5.在X光膠片暗盒內(nèi)面鋪一張面積大于膜的保鮮膜。將雜交膜貼在保鮮膜上,將保鮮膜折起來(lái)*包裹雜交膜,去除氣泡和皺褶,可剪去邊緣部多余的保鮮膜。用濾紙吸去多余的發(fā)光工作液。用膠帶將覆蓋雜交膜的保鮮膜固定在暗盒內(nèi),蛋白帶面向上。
 
  6.在黑暗中放入X光膠片,分別曝光不同的時(shí)間如數(shù)秒到數(shù)分鐘。顯影沖洗。
 
  PIERCE超敏型發(fā)光液注意事項(xiàng):
 
  1.步驟1-5可在日光燈下操作;但發(fā)光液曝露于強(qiáng)光下時(shí)間過(guò)久靈敏度可能略有降低,移到暗房操作可避免之。戴手套可以避免在膜上留下手印。
 
  2.長(zhǎng)時(shí)間曝光或蛋白過(guò)量,將加深背景并使條帶強(qiáng)弱變化失去線性關(guān)系。曝光不足則條帶模糊。
 
  3.發(fā)光工作液孵育約1分鐘后膜上的條帶發(fā)光。強(qiáng)條帶發(fā)光在暗房中肉眼可見(jiàn),低豐度蛋白條帶發(fā)光較弱甚至肉眼不可見(jiàn)但可使X光膠片曝光。不能簡(jiǎn)單以肉眼觀察判斷條帶發(fā)光時(shí)間。肉眼不可見(jiàn)的熒光實(shí)際上可持續(xù)數(shù)小時(shí)并使X光膠片感光,因而弱帶可曝光1-10小時(shí)。如果曝光后條帶不佳,可用洗膜緩沖液洗膜,重新孵育二抗,然后重新用ECL發(fā)光和曝光。
 
  4.由于PIERCE超敏型發(fā)光液極其靈敏,強(qiáng)烈推薦大多數(shù)進(jìn)口抗體起始濃度為一抗1:1000-1:4000,二抗1:2000-1:5000??贵w濃度過(guò)高將造成高背景或沒(méi)有條帶,導(dǎo)致失敗!
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